NGS基礎知識④：ショートリードとロングリードの違いとは？

最も大きな違いは「1本の配列として読める長さ」

ショートリードとロングリードの最も分かりやすい違いは、読み取った配列である「リード」の長さです。ショートリードは一般に数十～数百塩基、ロングリードは数千～数万塩基を読み取り、方式や試料の条件によってはさらに長い配列を取得できます。

短い配列を大量に取得して変異や発現量を比較するならショートリード、配列のつながりや複雑な構造を調べるならロングリードが候補になります。[1,2]

比較項目	ショートリード	ロングリード
リード長	一般に数十～数百塩基	一般に数千～数万塩基
主な用途	多数検体の変異解析、遺伝子発現量の比較	ゲノム構築、構造変異、転写産物の構造解析
反復配列	配列の位置や接続を決めにくい場合がある	前後の配列まで読めれば、位置関係を判断しやすい
試料の条件	断片化したDNAでも対応できる場合がある	長いリードを得るには、DNAの品質が重要
費用の傾向	多数検体・大量データの取得で有利な場合が多い	方式、必要データ量、解析目的によって異なる

なお、リード長とデータ量は別の指標です。 同じ塩基数のデータでも、短いリードを多数取得する場合と、長いリードを取得する場合では、得意な解析が異なります。データ量の考え方は、「NGS基礎知識③：解析に必要なデータ量の考え方」で解説しています。

ショートリード：多数の配列を読み、違いや量を比較する

ショートリードでは、IlluminaやMGIのDNBSEQなどが広く使われています。例えば「PE150」は、DNA断片の両端を150塩基ずつ読む条件です。断片全体を連続して300塩基読むという意味ではありません。

変異解析や遺伝子発現量の比較に適する

高品質な参照ゲノムがある場合、取得したリードを照合して、SNPや短い挿入・欠失（InDel）などを調べられます。多数の個体や微生物株を比較する研究でも利用されています。

RNA-seqでは、各遺伝子に対応するリードを数えて発現量を評価します。薬剤処理の前後や培養条件の違いなど、多数検体の発現比較を行いたい場合に適しています。

反復配列や複雑な構造には制約がある

ゲノムには、よく似た配列が複数の場所に存在する「反復配列」があります。短いリードが反復領域の中に収まると、どの場所に由来するかを決められない場合があります。

この問題は、配列をつなぎ合わせるde novoアセンブリにも影響します。反復領域の前後を正しく接続できず、ゲノムが複数の配列に分かれてしまうことがあります。

ショートリードでも、大きな挿入・欠失、逆位、転座などの構造変異は解析できます。ただし、反復配列や複雑な変化を含む領域では、検出・解釈が難しくなる場合があります。[3]

ロングリード：配列のつながりを捉える

代表的な技術は、PacBioとOxford Nanopore Technologies（ONT）です。

PacBioのHiFiシーケンスは、同じDNA分子を繰り返し読み、その情報をまとめることで、長いリードと高い塩基精度を両立します。ONTは、DNAやRNAがナノポアを通過するときの電流変化から配列を読み取ります。

ロングリードを一律に「精度が低い技術」と捉えるのは適切ではありません。 精度やエラーの特徴は、プラットフォーム、試薬、解析方法によって異なります。

ゲノム構築や構造変異の解析に役立つ

長いリードが反復領域と両側の固有配列まで覆えば、配列の位置関係を判断しやすくなります。このため、ロングリードは連続性の高いゲノムの構築に役立ちます。[1,2]

細菌では、染色体やプラスミドを完全長に近い形で再構築できる場合があります。ただし、必要な深度や試料の品質、ゲノムの構造によって結果は変わります。[4]

構造変異についても、変化の境界と周辺配列をまとめて読めるため、構造を捉えやすくなります。また、複数の変異が同じ染色体上にあるかを調べる「フェージング」にも適しています。父由来・母由来まで判定する場合は、親の配列情報などの追加情報を用います。

RNAでは転写産物の構造を調べやすい

一つの遺伝子から、エクソンの組み合わせなどが異なる複数の転写産物が作られることがあります。これらは「アイソフォーム」と呼ばれます。

ショートリードRNA-seqでは、短い断片の情報から転写産物の構造を推定します。一方、ロングリードRNA解析では、長い配列からエクソンの組み合わせを確認し、アイソフォームを識別しやすくなります。[1]

PacBioのIso-SeqはcDNAを、ONTは方法に応じてcDNAまたはRNAそのものを読み取ります。ただし、RNAの品質や転写産物の長さなどによっては、全長を取得できない場合もあります。

長いDNAを保つことが重要

ロングリードの長さを活かすには、DNAをできるだけ分解せずに抽出・保存する必要があります。DNA量が十分でも、短く断片化していると、期待した長さのリードが得られないことがあります。

また、ロングリードシーケンスでは増幅を挟まない場合に塩基配列とDNAメチル化情報も同時に取得できます。

目的に応じて選び、必要なら組み合わせる

ショートリードとロングリードの使い分けにおいては、予算や検体規模、解析で得たい情報を整理する事が重要です。

例えば、代表株のゲノムをロングリードで構築し、それを参照配列として、多数の株をショートリードで比較する方法もあります。

bitBiomeでは、解析目的と試料の状態に応じて、ショートリード・ロングリードの選択をご相談いただけます。調べたい内容と、用意できる試料をお聞かせください。