NGS基礎知識①：次世代シーケンスとは？概要と基本原理

次世代シーケンス（NGS：Next Generation Sequencing）とは、多数のDNA断片の塩基配列を並列に読み取る技術です。ゲノム配列や遺伝的な変異の解析、遺伝子発現解析、微生物群集の解析など、幅広い研究に利用されています。NGSは、選択する解析手法によって得られる情報が異なります。この記事では、NGSの基本原理とサンガー法との違い、主な用途、解析の流れを紹介します。

次世代シーケンスの基本原理

DNAの配列は、A・T・G・Cという4種類の塩基の並びで表されます。DNAにはAとT、GとCが対になる性質があり、元のDNAを鋳型にして、対応する塩基が並ぶ「相補鎖」を合成できます。NGSには複数の方式がありますが、ここでは広く利用されているIlluminaの方式を例に説明します。

Illuminaでは、DNA断片をフローセルと呼ばれる基板上で増幅し、同じ配列を持つDNAの集まり（クラスター）を作ります。それぞれのクラスターで相補鎖を合成し、塩基が1つ取り込まれるたびに蛍光信号を撮影して、どの塩基が加わったかを判別します。

使う塩基には、合成を一時的に止める仕組みがあります。1塩基分の信号を読み取った後、蛍光標識と合成を止める部分を除き、次の塩基を取り込ませます。この「合成・撮影・次の合成の準備」を繰り返して、塩基の並びを読み取ります。[1]

この方式をSequencing by Synthesis（SBS：合成によるシーケンス）と呼びます。多数のクラスターで並列に読み取りを進めるため、一度に大量の配列データを得られます。読み取られた一つ一つの配列データが「リード」です。

次世代シーケンスと従来型手法（サンガー法）の原理の違い

サンガー法も、元のDNAを鋳型にして相補鎖を合成します。ただし、配列を読み取る仕組みが異なります。

一般的なサンガー法では、通常の塩基の材料に加えて、取り込まれるとその先の合成が止まる、蛍光標識付きの材料（ddNTP）を使います。合成が止まる位置は分子ごとに異なるため、長さが1塩基ずつ違うDNA断片ができます。これらをキャピラリー電気泳動で長さごとに分離します。短い断片から順に検出部を通過する際、末端の蛍光を読み取り、最後に取り込まれた塩基を判別します。その順番をたどることで配列が分かります。[2]

つまり、サンガー法は「合成した断片を長さで分け、末端の塩基を順番に読む方法」です。一方、Illuminaは「相補鎖を合成する各段階で、取り込まれた塩基を読む方法」です。

それぞれの大きな違いは、同時に解析できる配列の規模です。サンガー法は、少数の検体について特定の領域の配列を確認する場合に適しています。一方、NGSは、多数の遺伝子領域やゲノム全体を調べる場合、大量の配列情報を必要とする場合に適しています。[1,3]

比較項目	サンガーシーケンス	次世代シーケンス
解析の規模	少数の標的領域を個別に解析	多数のDNA断片を並列に解析
主な用途	特定遺伝子やプラスミドの配列確認など	ゲノム解析、遺伝子発現解析、微生物群集解析など
得意な場面	少数の検体・標的領域を確認したい場合	広い範囲を網羅的に調べたい場合
コスト面	少数の標的では費用を抑えやすい	大量の配列を取得する場合に効率がよい

NGSを選べば、どのような研究でも安く、短期間で解析できるわけではありません。調べたい領域の数、検体数、必要な情報、予算などを踏まえて選ぶことが大切です。

次世代シーケンスが活用できる研究分野・目的の具体例

NGSは、DNAに記録された情報を調べる研究だけでなく、遺伝子発現や微生物群集の構成を調べる研究にも利用できます。代表的な用途は次のとおりです。

知りたいこと	主な解析手法	得られる情報の例
対象の生物がどのようなゲノム配列や遺伝子を持つか	全ゲノム解析（WGS）	ゲノム配列、遺伝子情報、参照配列との違い
対象の生物の遺伝子発現が条件によってどう変わるか	トランスクリプトーム解析（RNA-seq）	遺伝子発現量、条件間で発現が変化する遺伝子
サンプル中の微生物群集がどう構成されているか	アンプリコン解析(16S rRNA遺伝子/18s rRNA遺伝子/ITS領域)	標的とする微生物群の分類群構成や相対的な割合
サンプル中の微生物群集がどのような遺伝子を持つか	ショットガンメタゲノム解析	微生物の分類情報、遺伝子情報、機能の推定

例えば、単離した微生物株のゲノムを調べる研究と、糞便や土壌に含まれる微生物群集を調べる研究では、適した解析手法が異なります。
また、DNAから機能に関わる遺伝子が見つかっても、その遺伝子が実際に発現しているか、目的とする機能が働いているかまでは、それだけでは判断できません。「何を知りたいか」に合わせて解析手法を選ぶ必要があります。
目的別の選び方については、関連記事「NGS基礎知識②：解析手法の選び方」で詳しく解説します。
またショートリードシーケンスでは長く連続した塩基配列を読み取ることは難しく、複雑なゲノムを持つ生物のアセンブリやリピート領域の解析には向いていません。
そのような目的に活用したい場合はロングリードシーケンスで解析するなど、目的に合わせてシーケンサーの機種を使い分けることも重要です。

NGS解析はどのように進むのか

一般的にNGSの解析は以下の流れで進みます。試料や手法により、必要な工程が異なります。[1,2]

１．解析対象サンプルからDNAまたはRNAを抽出し、量・品質を確認
２．アダプターと呼ばれる配列の付加などの前処理によりシーケンス用ライブラリを作製
３．NGSで塩基配列を読み取り、配列データを取得
４．シーケンスリードの品質を確認し、ゲノム配列の構築（アセンブリ）や遺伝子発現量のカウントなど、解析手法に合わせて解析を実施

依頼時には、シーケンスデータの取得だけでよいのか、ゲノム配列の構築や比較解析まで必要なのかを整理しておくと、必要な作業と納品内容を確認しやすくなります。

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bitBiomeでは、全ゲノム解析、RNA-seq、アンプリコン解析、ショットガンメタゲノム解析などのNGS受託解析サービスを提供しています。研究目的やサンプルの種類、ご予算、希望納期を伺い、適したシーケンス手法やデータ解析をご提案します。解析方法が決まっていない段階でも、お気軽にご相談ください。